當(dāng)牙周炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病發(fā)生時(shí)，巨噬細(xì)胞被募集并極化為M1促炎表型。這些長(zhǎng)期活動(dòng)的M1巨噬細(xì)胞隨后產(chǎn)生高水平的NO、活性氧和促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致持續(xù)的炎癥反應(yīng)。促炎細(xì)胞因子可促進(jìn)成骨細(xì)胞產(chǎn)生RANKL的受體激活劑，導(dǎo)致破骨細(xì)胞過度形成，從而破壞骨穩(wěn)態(tài)。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）因具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力而被廣泛用于各種炎癥性疾病的治療，包括牙周炎。越來越多的證據(jù)表明，MSCs的治療效果主要?dú)w因于其分泌的旁分泌因子，其中最關(guān)鍵的是細(xì)胞外囊泡（EV），包括外泌體（EXO）、小細(xì)胞外囊泡（sEV）。有研究表明，MSC-sEV在免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)組織修復(fù)再生等治療效果上與MSC類似，且在安全性、存儲(chǔ)和給藥方面比MSC療法更具優(yōu)勢(shì)，因此被認(rèn)為是一種大有潛力的治療方法。

牙髓干細(xì)胞（DPSCs）是從成人牙髓中分離出來的一種間充質(zhì)干細(xì)胞，其容易獲得，且不會(huì)引起任何倫理問題。據(jù)報(bào)道，牙髓干細(xì)胞來源小細(xì)胞外囊泡（DPSC-sEV)顯示出比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源小細(xì)胞外囊泡（BMSC-sEV）更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。不過，DPSC-sEV能否直接抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和破骨細(xì)胞的生成，目前還是一個(gè)未知數(shù)。此外，體外培養(yǎng)的MSCs通常暴露在常氧（21% O2）條件下，而體內(nèi)相當(dāng)一部分MSCs存在于低氧環(huán)境中（2%-8%），那么在低氧條件下產(chǎn)生的DPSC-sEV是否能發(fā)揮更好的治療效果？

為此，中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)的DPSC-sEV通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化和破骨細(xì)胞生成來改善炎癥性骨溶解。這項(xiàng)成果于近日發(fā)表在《Bioactive Materials》雜志上，有望為骨髓炎、牙周炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等常見病的治療帶來一種新策略。

文獻(xiàn)封面截圖[1]

研究材料與方法

研究人員從SD大鼠上頜中切牙的牙髓中分離出DPSCs，并鑒定了DPSCs的成骨分化和成脂分化能力（OriCell?MSC成脂誘導(dǎo)分化試劑盒、OriCell?茜素紅染色液、OriCell?油紅O染色液等產(chǎn)品為該項(xiàng)研究助力）。

之后，研究人員從DPSCs中分離出小細(xì)胞外囊泡（sEV），并開展了一系列的分析。在體內(nèi)研究中，使用了LPS誘導(dǎo)的小鼠顱骨炎性骨吸收模型，體外研究則使用了RAW264.7巨噬細(xì)胞。

技術(shù)路線

從DPSCs中分離出sEV，發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)了DPSCs的sEV釋放

Hypo-sEV誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化并抑制破骨細(xì)胞生成，從而改善了LPS誘導(dǎo)的炎癥性骨吸收

通過miRNA表達(dá)譜分析等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Hypo-sEV的治療效果是由miR-210-3p介導(dǎo)的

miR-210-3p通過抑制NF-κB1 p105表達(dá)，來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和破骨細(xì)胞的形成

研究結(jié)果

01

Hypo-sEV促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化并抑制破骨細(xì)胞生成

在分離出DPSCs后，研究人員經(jīng)過流式分析和免疫熒光分析，確認(rèn)培養(yǎng)的DPSCs具有MSC的間質(zhì)表型，并具備多潛能分化能力。隨后，他們通過超速離心法從常氧（normoxic conditions）和低氧(hypoxic conditions)條件下培養(yǎng)的DPSCs上清液中分離出sEV，分別命名為Nor-sEV和Hypo-sEV。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種sEV都表現(xiàn)出典型的EV特征，但Hypo-sEV的濃度更高，且蛋白質(zhì)濃度也明顯更高。而且，通過sEV蛋白標(biāo)志物分析，發(fā)現(xiàn)低氧明顯增加誘導(dǎo)了DPSCs釋放sEV。

為了比較這兩種sEV對(duì)炎癥性骨溶解的治療效果，研究人員使用了LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性骨吸收模型。通過micro-CT掃描和組織學(xué)檢查評(píng)估，他們發(fā)現(xiàn)Nor-sEV對(duì)LPS誘導(dǎo)的骨溶解未能表現(xiàn)出明顯的治療效果。相反，Hypo-sEV挽救了小鼠顱骨基質(zhì)的炎癥性骨溶解，即提高了BV/TV值，并減少了骨侵蝕面積（圖1）。這些結(jié)果表明，Hypo-sEV明顯改善了LPS誘導(dǎo)的體內(nèi)炎癥性骨吸收。

圖1. Hypo-sEV在體內(nèi)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥性骨吸收[1]

由于巨噬細(xì)胞從M1到M2的表型轉(zhuǎn)變可促進(jìn)骨修復(fù)，故研究人員接著分析了Hypo-sEV是否可促進(jìn)體內(nèi)的巨噬細(xì)胞M2極化。LPS導(dǎo)致CD68+iNOS+巨噬細(xì)胞（M1表型）數(shù)量增加，但Hypo-sEV和Nor-sEV的加入使得顱骨基質(zhì)中出現(xiàn)了更多的CD68+Arg1+巨噬細(xì)胞（M2表型），且Hypo-sEV處理后的M1巨噬細(xì)胞更少，M2巨噬細(xì)胞更多。與Nor-sEV相比，Hypo-sEV明顯抑制IL-1β的表達(dá)，促進(jìn)IL-10和Arg1的表達(dá)。由此可見，Hypo-sEV可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化。

炎癥性骨吸收是由破骨細(xì)胞的過度生成引起的，因此研究人員還研究了Hypo-sEV是否能抑制體內(nèi)破骨細(xì)胞的生成。他們發(fā)現(xiàn)，Nor-sEV和Hypo-sEV都減少了LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞（TRAP陽(yáng)性）數(shù)量，且Hypo-sEV組的破骨細(xì)胞數(shù)量低于Nor-sEV組。體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也表明，這兩種sEV抑制了RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，且Hypo-sEV組的抑制效果優(yōu)于Nor-sEV組。這些數(shù)據(jù)顯示，Hypo-sEV在體內(nèi)和體外直接抑制了破骨細(xì)胞生成。

02Hypo-sEV通過上調(diào)miR-210-3p表達(dá)而發(fā)揮作用

為了進(jìn)一步分析這背后的分子機(jī)制，研究人員決定從miRNA研究入手。他們利用新一代測(cè)序分析了Nor-sEV和Hypo-sEV的miRNA表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Nor-sEV相比，Hypo-sEV中有45個(gè)miRNA上調(diào)，64個(gè)miRNA下調(diào)。在重點(diǎn)關(guān)注與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)或破骨細(xì)胞分化有關(guān)的miRNA后，他們還發(fā)現(xiàn)Hypo-sEV中的miR-7578、miR-187-3p和miR-210-3p水平相對(duì)于Nor-sEV升高。后續(xù)分析顯示，miR-210-3p在介導(dǎo)Hypo-sEV的治療效果方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

接著，通過對(duì)RAW264.7細(xì)胞與兩種sEV的共培養(yǎng)分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了Hypo-sEV可以將miR-210-3p遞送到巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞中。miR-210-3p抑制劑提高了促炎細(xì)胞因子和iNOS的表達(dá)，同時(shí)降低了IL-10和Arg1的表達(dá)，減弱了Hypo-sEV誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化的能力。此外，miR-210-3p抑制劑也部分降低了Hypo-sEV抑制破骨細(xì)胞形成的能力以及破骨細(xì)胞生成相關(guān)基因的表達(dá)（圖2）。這些結(jié)果表明，Hypo-sEV通過上調(diào)miR-210-3p表達(dá)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化并抑制破骨細(xì)胞生成。

圖2. Hypo-sEV在體外通過遞送miR-210-3p而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化并抑制破骨細(xì)胞生成[1]

之后，實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移到小鼠模型上繼續(xù)進(jìn)行。為了進(jìn)一步確認(rèn)Hypo-sEV的治療效果是由miR-210-3p介導(dǎo)的，研究人員在LPS誘導(dǎo)的炎癥性骨吸收模型中使用了miRNA抑制劑antagomir-210-3p。結(jié)果顯示，antagomir-210-3p明顯消除了Hypo-sEV的治療作用。而且與對(duì)照相比，antagomir-210-3p的加入導(dǎo)致M1型巨噬細(xì)胞增加，M2型巨噬細(xì)胞減少。這些結(jié)果證實(shí)。miR-210-3p通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化和抑制破骨細(xì)胞生成而明顯改善了LPS誘導(dǎo)的炎癥性骨溶解。

后續(xù)的分析發(fā)現(xiàn)，miR-210-3p直接靶向了NF-κB1的3′UTR，而NF-κB通路的激活對(duì)巨噬細(xì)胞M1極化和破骨細(xì)胞生成至關(guān)重要。miR-210-3p通過抑制NF-κB1 p105表達(dá)來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和破骨細(xì)胞的形成。

結(jié)論

圖3. miR-210-3p抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥性骨吸收的示意圖[1]

這項(xiàng)研究表明，低氧預(yù)處理不僅誘導(dǎo)了DPSC-sEV的分泌，還增強(qiáng)了DPSC-sEV介導(dǎo)的對(duì)LPS誘導(dǎo)的骨溶解的治療效果。其中，miR-210-3p通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化和抑制破骨細(xì)胞生成來保護(hù)骨骼。

因此，低氧誘導(dǎo)的DPSC-sEV和miR-210-3p的這種“一石二鳥”作用有助于開發(fā)新策略來治療炎癥性或感染性骨溶解。

文章轉(zhuǎn)載自：OriCell細(xì)胞生物學(xué)微信公眾號(hào)